炎症性肠病（Inflammatory bowel disease，IBD）是一种慢性免疫介导的疾病，包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，其特征是胃肠道中存在过量的免疫细胞浸润和复杂的炎症网络。这种疾病的发病机制尚未完全明了，但已知与遗传、环境、微生物和免疫系统的相互作用有关。

巨噬细胞作为关键的先天免疫细胞，在维持肠道稳态和调节炎症反应中起着双重作用。在正常情况下，巨噬细胞有助于清除病原体和维持肠道屏障的完整性。然而，在IBD中，巨噬细胞可能会过度激活，导致炎症反应失控，从而损害肠道黏膜屏障，引发或加剧炎症。

Tim-3（T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域-3）是免疫细胞的一种负调节因子，起初被认为是Th1细胞的标志物，介导T细胞的耗竭。然而，近年来的研究表明，Tim-3在巨噬细胞等多种固有免疫细胞中均表达，包括T细胞、巨噬细胞等。然而，巨噬细胞中Tim-3在肠道炎症中的作用尚不清楚。

2024年4月，南昌大学第一附属医院的谢勇教授团队在《Redox Biology》发表题为“Macrophage Tim-3 maintains intestinal homeostasis in DSS-induced colitis by suppressing neutrophil necroptosis”的论文。

该研究在IBD患者和模型小鼠上研究了巨噬细胞Tim-3的作用，发现巨噬细胞Tim-3通过抑制中性粒细胞坏死性凋亡，在维持肠道稳态中发挥保护作用。

具体研究结果

（1）炎症性肠病（IBD）中，结肠巨噬细胞Tim-3表达水平显著上调

通过双免疫荧光染色、单细胞RNA测序分析以及基因表达分析IBD患者和健康对照组的结肠组织，研究人员发现，在炎症性肠病（IBD）患者的结肠组织中，巨噬细胞Tim-3的表达水平显著高于健康对照样本。小鼠实验结果也显示，DSS诱导的结肠炎小鼠模型中，巨噬细胞上的Tim-3表达明显增加。

（2）巨噬细胞中的Tim-3可以保护小鼠免受DSS诱导的结肠炎

接下来，研究人员构建了巨噬细胞特异性Tim-3缺陷（Tim-3^M-KO）小鼠模型，用相同浓度的DSS处理其与WT小鼠，结果发现：Tim-3^M-KO小鼠表现出更严重的疾病症状，如生存率降低、疾病活动指数升高、结肠长度缩短和脾脏重量增加等。

◆ 巨噬细胞Tim-3缺失加重了结肠的炎症和M1极化

qRT-PCR分析显示，DSS处理后的Tim-3^M-KO小鼠结肠组织中促炎性细胞因子（如TNF-α、IL-1β和IL-6）和趋化因子（如CCL2、CCL3、CCL4、CXCL1和CXCL2）的表达显著增加。

免疫组化染色显示，Tim-3^M-KO小鼠结肠组织中M1型巨噬细胞标志物CD86和iNOS的表达显著增强。

F4/80（巨噬细胞标志物）和Ly6G（中性粒细胞标志物）的免疫荧光染色结果显示，Tim-3^M-KO小鼠结肠组织中巨噬细胞和中性粒细胞的浸润显著增加。

◆ 巨噬细胞Tim-3缺失会促进结肠炎小鼠结肠组织中中性粒坏死性凋亡

RNA-seq分析显示，DSS处理后的Tim-3^M−KO小鼠结肠组织中，和TNF通路相关的细胞反应显著上调，而TNF-α是通过TNF-α/RIP1/RIP3/MLKL信号传导引起坏死性凋亡的经典起始因子。

进一步做免疫组化和免疫荧光染色结果显示，DSS处理后的Tim-3^M-KO小鼠结肠组织中，与坏死性凋亡相关的关键分子RIP1、RIP3和MLKL的磷酸化水平显著上调。在Tim-3^M-KO小鼠的结肠组织中，p-MLKL从细胞质向细胞膜的转移显著增加。

Western blot分析进一步证实，DSS处理后的Tim-3^M-KO小鼠结肠组织中RIP1、RIP3和MLKL的磷酸化水平显著上调

◆ 在Tim-3^M−KO小鼠中，通过药理学手段抑制RIP1或RIP3活性可以显著减轻DSS诱导的结肠炎症状

为了评估RIP1或RIP3活性抑制对DSS诱导的结肠炎的影响，研究者们对Tim-3^M−KO小鼠进行为期7天的3% DSS饮水处理，并给予RIP1或RIP3抑制剂（Nec-1和GSK-872）进行腹腔注射治疗。

实验结果显示，Nec-1和GSK-872治疗显著提高了Tim-3^M−KO小鼠的生存率，延长了结肠长度，降低了疾病活动指数，减少了脾脏重量。

组织病理学分析显示，Nec-1和GSK-872治疗显著改善了Tim-3^M−KO小鼠的结肠组织病理损伤，表现为炎症细胞浸润减少、溃疡/侵蚀减少、隐窝结构更完整。

双免疫荧光染色结果显示，Nec-1和GSK-872治疗显著减少了Tim-3^M−KO小鼠结肠组织中中性粒细胞和巨噬细胞的浸润。

免疫组化染色结果显示，Nec-1和GSK-872治疗显著抑制了DSS诱导的Tim-3^M−KO小鼠结肠组织中RIP1、RIP3和MLKL的磷酸化。

免疫组化和免疫荧光染色结果显示，在DSS处理后的Tim-3^M-KO小鼠结肠组织中，p-MLKL（坏死性凋亡标志物）的表达主要集中在Ly6G+中性粒细胞上，而在WT小鼠中，p-MLKL主要表达在F4/80+巨噬细胞上。

qRT-PCR结果显示，在Tim-3^M-KO小鼠的结肠组织中，与中性粒细胞趋化相关的细胞因子（如IL-8、CXCR1和CXCR2）的表达显著增加。

免疫组化染色结果显示，在Tim-3^M-KO小鼠的结肠组织中，髓过氧化物酶（MPO，中性粒细胞标志物）的表达显著增加。

GSEA分析显示，在Tim-3^M-KO小鼠的结肠组织中，与中性粒细胞趋化相关的通路显著富集。

（3）Tim-3缺陷的巨噬细胞诱导中性粒细胞趋化并引发坏死性凋亡

在体外共培养实验中，Tim-3缺陷的THP-1巨噬细胞上清液能够显著增加HL-60细胞向炎症部位的迁移能力。Tim-3缺陷的THP-1巨噬细胞表现出更多的F-actin聚合，IL-8和CXCR1/2的表达明显上调，p-MLKL的表达明显上调。

通过ELISA、免疫荧光染色和中和抗体实验，发现Tim-3缺失的巨噬细胞通过释放IL-8和TNF-α来诱导中性粒细胞的趋化和坏死性凋亡。Nec-1或GSK-872可以显著抑制Tim-3缺陷的THP-1巨噬细胞诱导的中性粒细胞坏死性凋亡。

◆ Tim-3在巨噬细胞中通过下调TLR4/NF-κB信号通路抑制炎症反应

Western blot结果显示，Tim-3缺陷的THP-1巨噬细胞在LPS刺激后，TLR4和p65（NF-κB亚单位）的表达显著增加，而Tim-3过表达的THP-1巨噬细胞则显示相反趋势。

免疫荧光染色结果显示，与WT THP-1巨噬细胞相比，Tim-3缺陷的THP-1巨噬细胞在LPS刺激后TLR4和p65的表达显著增加。

使用TLR4抑制剂TAK-242和NF-κB抑制剂BAY11-7082处理Tim-3缺陷的THP-1巨噬细胞后，结果显示炎症因子TNF-α和IL-8的表达显著下调。药物处理显著抑制了THP-1巨噬细胞上清液对HL-60细胞迁移和p-MLKL表达的促进作用。

TLR4和NF-κB抑制剂显著降低了Tim-3缺陷的THP-1巨噬细胞在LPS刺激后的CCL2、CCL3、CCL4、CXCL1和CXCL2的表达，显著降低了Tim-3缺陷的THP-1巨噬细胞的Transwell迁移能力。

综上所述，实验数据表明，Tim-3在巨噬细胞中通过下调TLR4/NF-κB信号通路抑制炎症反应，进而抑制炎症相关因子的表达和迁移能力。

（4）ROS在巨噬细胞Tim-3缺陷介导的坏死中起着关键作用

通过DHE染色和ROS检测，发现在DSS处理的Tim-3M-KO小鼠结肠组织中，ROS水平显著高于WT小鼠。Nec-1或GSK-872（坏死性凋亡抑制剂）处理能够显著降低Tim-3^M-KO小鼠结肠组织中的ROS水平。

在体外实验中，Nec-1或GSK-872处理显著降低了THP-1巨噬细胞产生的ROS水平。在体外共培养实验中，Tim-3缺陷的THP-1巨噬细胞上清液能够显著增加HL-60细胞中的ROS水平，而Nec-1或GSK-872处理能够显著降低这一效应。

Nec-1或GSK-872处理显著降低了DSS处理后的Tim-3^M-KO小鼠结肠组织中p-MLKL的表达，而NAC（ROS清除剂）处理能够显著降低DSS处理后的Tim-3M-KO小鼠结肠组织中p-MLKL的表达。

综上所述，实验数据表明，ROS在巨噬细胞Tim-3缺陷介导的坏死中起着关键作用，通过抑制坏死性凋亡信号通路，ROS可以显著降低炎症相关因子的表达和迁移能力。

（5）巨噬细胞Tim-3通过抑制中性粒细胞坏死来维持肠上皮屏障

通过免疫荧光染色和蛋白质表达分析，发现在DSS处理的Tim-3^M-KO小鼠的结肠组织中，紧密连接蛋白ZO-1的表达显著降低，而Nec-1或GSK-872处理后，ZO-1的表达显著增加。

在体外共培养实验中，Tim-3缺陷的巨噬细胞与中性粒细胞共培养的上清液能够显著降低Caco-2细胞中ZO-1的表达，而Nec-1或GSK-872处理能够显著抑制这一效应。

在体外共培养实验中，TNF-α中和抗体处理能够显著抑制Tim-3缺陷的巨噬细胞与中性粒细胞共培养的上清液对Caco-2细胞中ZO-1表达的抑制效应。

在体外共培养实验中，Tim-3缺陷的巨噬细胞与中性粒细胞共培养的上清液能够显著增加HMGB1的表达，而Nec-1或GSK-872处理能够显著抑制这一效应。

综上所述，实验数据表明，巨噬细胞Tim-3通过抑制中性粒细胞坏死来维持肠上皮屏障，进而抑制肠道炎症的发展。

小结

该研究关注到了巨噬细胞Tim-3这种负性调控因子在IBD中的保护作用，利用了Tim-3^M-KO模型鼠以及体外实验，研究了Tim-3缺失的巨噬细胞通过TLR4/NF-κB信号通路，募集中性粒细胞，并通过TNF-α/RIP1/RIP3/MLKL信号传导通路增加中性粒坏死性凋亡，从而加重IBD炎症的过程。反向说明了巨噬细胞Tim-3对于IBD发病的保护作用。