是2022年发表在Gastroenterology上的“High-FatDiet Promotes Colorectal Tumorigenesis Through Modulating Gut Microbiota and Metabolites”（IF=33.9），该文揭示了高脂饮食（HFD）通过调节肠道菌群和代谢产物来促进结直肠癌形成的过程。

 

 

 

研究背景

与其他肿瘤不同，结直肠癌（CRC）在肿瘤发展过程中直接与数万亿肠道微生物相互作用。肠道菌群的组成受多种因素的影响，包括饮食，药物和遗传改变等，而微生物特征的改变会引起肠道菌群失调和CRC。尤其是肠道菌群在结直肠肿瘤形成的早期阶段就会受到干扰，并在肿瘤进展过程中恶化。此外，微生物衍生的代谢产物，例如胆汁酸和短链脂肪酸，也可能促进或抑制CRC的发展。据报道，高脂饮食和肠道微生物群失衡都与CRC相关，但是其中的复杂关系并不清楚。

 

 

研究思路

1.HFD促进AOM和APC^min/+小鼠模型中依赖肠道微生物群的CRC发展

为了研究HFD在结直肠肿瘤发生中的作用，研究者对常规AOM处理的雄性C57BL/6小鼠进行投喂高脂饮食（HFD）、对照饮食（CD）以及HFD联合抗生素处理（HFD+Abx）（图1A）。一段时间后对小鼠进行结肠镜检查，在HFD喂养的小鼠中存在肉眼可见的肿瘤，但在CD喂养或抗生素治疗的HFD喂养的小鼠中未观察到明显的肿瘤(图1B)。而抗生素对肠道菌群的耗竭对HFD喂养小鼠的体重和肥胖体重没有明显影响(图1C)。HFD喂养的小鼠的结直肠肿瘤数量和体积也明显大于CD喂养的小鼠(图1D)。结肠切片的组织学检查(图1E)证实HFD喂养的小鼠与CD喂养的小鼠相比，小鼠发生腺癌、高级别和低级别不典型增生的比例增加，而HDF+Abx组小鼠的腺癌，高度不典型增生和低度不典型增生的比例降低（图1E）。此外，HFD喂养的小鼠的结肠切片显示出更多的Ki-67阳性细胞，表明HFD喂养的小鼠中的细胞增殖增加（图1F），而在HDF+Abx组小鼠中，Ki-67阳性细胞有所减少。

 

图 1

 

为了验证这些发现，研究者又建立了转基因APC^min/+小鼠模型（图2A），与AOM诱导的结肠肿瘤小鼠模型的结果一致。HFD显著增加APC^min/+小鼠的体重和肥胖重量，并且HFD+Abx组小鼠的体重和肥胖重量较HFD组相比没有很大变化(图2B)。HFD喂养的APC^min/+小鼠的结直肠肿瘤数目，体积显著高于CD喂养的APC^min/+小鼠(图2C)，而抗生素对肠道菌群的耗竭显著降低了HFD喂养的APC^min/+小鼠的肿瘤数量和体积（图2C）。此外，结肠切片的组织学检查证实，与CD喂养的小鼠相比，HFD喂养的小鼠表现出更大比例的腺癌和高度不典型增生（图2D）以及更多的Ki-67阳性细胞，而HFD+Abx组小鼠较单纯HFD组小鼠的Ki-67阳性细胞减少（图2E）。这些一致的发现表明HFD促进结直肠肿瘤的发生，肠道菌群可能在介导HFD相关CRC发展中起重要作用。

 

图 2

 

2.HFD诱导的肠道菌群失调促进CRC的发展

为了探讨肠道微生物失调在HFD相关CRC发展中的潜在作用，研究者在AOM模型中对CD、HFD和抗生素喂养的HFD小鼠的粪便样本进行了鸟枪法宏基因组测序。使用主成分分析(PCA)，在三者中中观察到微生物群组成的区别。与CD喂养的小鼠相比，HFD喂养的小鼠中的细菌多样性和细菌丰富度较低（图3A）。几种细菌类群在三组小鼠中存在差异（图2B）。与CD组小鼠相比，HFD组小鼠中潜在致病菌（Alistipes sp. Marseille-P5997 和Alistipes sp. 5CPEGH6）显著增多，然而保护性菌群（Parabacteroides distasonis和Parabacteroides sp. CT06）显著减少（图3C）。使用定量聚合酶链反应在APC^min/+中也发现了相同的结果。另外，共培养实验表明在CRC系（Caco-2 和 HCT116）中，P.distasonis抑制细胞生长，而Alistipes sp.促进细胞生长（图3D）。这表明提示HFD诱导的肠道微生物组成的变化至少部分促进CRC的发展。

 

图 3

 

3.HFD诱导的肠道菌群失调损害肠道屏障功能

为了探讨肠屏障功能在HFD相关结直肠肿瘤发生中的作用，研究者通过测定血清脂多糖(LPS)水平，探讨HFD对小鼠结肠细胞旁通透性的影响。在AOM小鼠模型中，与CD组小鼠相比，HFD处理的小鼠血清LPS浓度升高（图3E）。同样地，透射电镜下的肠屏障结构证实了HFD喂养小鼠结肠细胞间连接的异常，包括顶端连接复合体和细胞旁间隙的扩大，表明屏障功能受损（图3F）。此外，紧密连接蛋白E-钙黏蛋白（一种细胞粘附分子）和Claudin-3（紧密连接的关键成分，是肠屏障完整性的标志）的表达在喂饲HFD的小鼠中显著降低（图3G）。E-钙粘蛋白和Claudin-3蛋白主要在CD组小鼠的结肠上皮细胞膜上表达，而在HFD组小鼠的结肠上皮细胞膜上表达不明显（图3H）。另一方面，用抗生素喂养的HFD小鼠的细菌耗竭部分恢复了HFD引起的屏障功能受损，在透射电镜下改善了肠道屏障结构（图3F），恢复了E-钙黏蛋白和Claudin-3蛋白的表达(图3G)及其分布和密度(图3H)。总之，这些结果表明，HFD至少部分通过引起肠道微生物失调而导致结肠屏障功能受损。

 

4.HFD调节的肠道菌群促进AOM处理的无菌小鼠的结直肠肿瘤发生

为了进一步验证HFD调节的微生物群在结直肠肿瘤发生中的作用，研究者将HFD喂养小鼠的粪便转移给AOM处理过的无菌小鼠（图4A）。粪便微生物群移植(FMT)不会改变AOM处理的无菌小鼠的体重和肥胖体重。与CD组相比，用HFD喂养的小鼠粪便样本灌胃的无菌小鼠显示出明显的Alistipes富集，肿瘤数目和体积增加（图4B）。在HFD-FMT-AOM小鼠中，结肠肿瘤经组织学证实为低度不典型增生，而且结肠肿瘤中Ki-67阳性细胞较对照组明显增多（图4C，D）。此外，与对照小鼠相比，在HFD-FMT-AOM小鼠的结肠组织中，E-钙粘蛋白和Claudin-3的表达降低，此外，E-钙粘蛋白和Claudin-3蛋白在HFD-FMT-AOM小鼠中被分解（图4E，F）。这些结果共同表明，HFD调节的肠道菌群通过损害肠道屏障功能而有助于结直肠肿瘤的发生。

 

图 4

 

5.HFD通过改变肠道代谢产物促进结直肠肿瘤的发生

为了揭示HFD诱导的代谢变化，研究者对CD喂养，HFD喂养和抗生素处理的HFD喂养AOM小鼠的粪便样本进行了代谢分析。肠道代谢物随着膳食脂肪摄入量和抗生素治疗而显著差异。与CD喂养的小鼠相比，在HFD喂养的小鼠中鉴定出差异代谢物，其中包括溶血磷脂酰胆碱（LPC）和LPC的下游代谢物LPA在内的甘油磷脂都是HFD喂养小鼠中上调最高的异常代谢物（图5B）。HFD喂养小鼠的上调代谢物富集在不同的代谢组学信号通路中。在这些途径中，甘油磷脂代谢是喂食HFD的小鼠改变的顶级途径（图5C）。另一方面，与HFD组相比，抗生素处理的HFD喂养小鼠恢复了改变的代谢物，LPA和LPC水平降低（图5D）。同样，肠道微生物群的消耗减少了包括甘油磷脂代谢在内的途径（图5E）。进行综合分析以确定HFD喂养小鼠中改变的肠道微生物与代谢物之间的潜在关联。我们发现Alistipes sp. Marseille-P5997、Alistipes sp. 5CPEGH6、Bifidobacterium animalis和Alistipes shahii的富集与LPA和LPC呈正相关。此外，Parabacteroides CT06和Parabacteroides Distasonis的消耗与LPA和LPC呈负相关（图5F）。这些结果表明，改变的肠道微生物群及其相关代谢物都有助于HFD相关的结直肠肿瘤发生。

 

图 5

 

6.HFD改变的代谢物有助于细胞增殖和细胞连接受损

为探讨HFD改变代谢物在结肠癌发生发展中的潜在作用，对2株结肠癌细胞株(Caco-2和HCT116)和1株正常结肠上皮细胞株（NCM460）进行了差异和非差异代谢物处理。与CD喂养的小鼠相比，HFD喂养的小鼠NDGA和神经酸显著减少。以喂HFD小鼠和喂CD小鼠之间的无差异代谢物之一肌苷作为阴性对照。共培养实验表明，NDGA对结肠癌细胞系Caco-2和HCT116的细胞增殖有明显的抑制作用，但对正常上皮细胞系NCM460的细胞增殖（图6A）和菌落形成（图6B）无明显抑制作用。此外，研究者分别用NDGA和神经酸来处理来源于患者的CRC类器官，发现NDGA和神经酸均能显著抑制CRC类器官的生长。

 

接下来，研究者专注于富含HFD的代谢物LPA的致癌作用。研究发现LPA显著促进了所有3个结肠细胞系的增殖（图6C）。细胞周期分析表明，与载体对照相比，LPA处理加速了 HCT116 中从 G1期到 S期的细胞周期进程，以及Caco-2 细胞中从G1 到S 和G2期的细胞周期进程（图6D）。一致地，在LPA处理的CRC细胞系中发现增殖细胞核抗原（PCNA），细胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表达上调以及P27的表达下调（图6E）。此外，研究者处理了有或没有LPA的患者来源的CRC类器官，以进一步确认LPA的致癌作用，并证明LPA显著促进了CRC类器官的生长和增殖（图6F）。接着研究了LPA是否会影响上皮屏障功能。与载体对照组相比，在LPA处理的HCT116，Caco-2和NCM460细胞中观察到E-钙粘蛋白和occludin蛋白表达显著降低，推断LPA可能会损害屏障功能（图6G）。综上所述，这些结果表明，HFD至少部分通过提高致癌代谢物LPA和消耗潜在的有益代谢物NDGA和神经酸来促进CRC的发展。