Cell报道:Mediator发挥功能的新机制

时间 : 2019-08-19

中介因子复合体（Mediator）在酵母中由25个亚基组成，在哺乳动物中含有33个亚基【1】。功能上，Mediator参与Pol II活化的各个阶段，调控转录过程。在转录起始阶段，Mediator与通用转录因子（general transcription factors，GTFs）相互作用，促进转录起始复合物（pre-initiation complex，PIC）的形成【2】和Pol II C端结构域（C-terminal domain，CTD）的磷酸化，Mediator还可促进结合增强子的TFs与启动子区域的转录机器间相互作用。同时，Mediator还可与POLR2M和超级延伸复合物相互作用，调控Pol II的暂停和延伸过程。

Mediator在结构上分成头部、中部、尾部和CDK8激酶（CKM）等模块【3】。MED14作为Mediator的骨架，具有促进模块之间相互作用，稳定复合物的功能【4】。头部和中部模块的亚基通过MED14形成一个功能性和结构性的核心，与Pol II相互作用；尾部具有可变性，包含与激活子和抑制子作用的亚基。目前关于Mediator的结构-功能关联都是以酵母对对象研究得到的，在哺乳动物中的作用还有待更多的研究。哺乳动物中含有8个多细胞动物特异性的亚基，而且部分亚基对于体外转录和胚胎发育都是必需的，提示了它们有助于增加高等生物的转录调控复杂性。

2019年8月8日，来自美国NIH的Rafael Casellas与科罗拉多大学Francisco J. Asturias在Cell杂志上发表文章A Pliable Mediator Acts as a Functional Rather Than an Architectural Bridge between Promoters and Enhancers，综合运用CRISPR-Cas9筛选系统、降解子实验、Hi-C和冷冻电镜等技术研究了哺乳动物Mediator（mammalian Mediator，mMED）的功能和结构，揭示了mMED尾部模块与核心模块的构象影响mMED-Pol II相互作用。该研究的另一亮点是揭示了虽然Mediator在功能上联系着启动子和增强子，但与传统的认识不同的是，启动子与增强子空间上的联系主要是由cohesin发挥的。

研究团队首先运用冷冻电镜技术解析了哺乳动物Mediator（mMED）复合物的结构，整体分辨率达到5.9埃。mMED结构中核心亚基，即头部、中部和MED14的排列与酵母的核心Mediator非常相似。根据mMED的结构定义出非核心区域，并且判定出所有非核心区域都归属于尾部模块。MED14的C端参与尾部模块的锚定，核心-尾部作用界面更为复杂和广泛，其中尾部和头部、中部都有额外的作用。mMED尾部可以分为两个相连的片段：靠近头部（head jaws）并环绕MED14 C端的小片段（～165kDa），包括MED15、MED27/3、MED28、MED29/2、MED30，其中MED15、MED27与骨架亚基MED14相邻；与Sc（啤酒酵母）尾部模块位置相对应的大片段（～380kDa），包括MED16、MED23、MED24/5、MED25，其中MED24的C端和中部模块的亚基MED1相连。

为了探究mMED的功能，研究团队利用CRISPR-Cas9在小鼠细胞中敲除Mediator各亚基进行分析。在小鼠B、T、ESCs细胞中的实验表明，88%的亚基在不同细胞中功能一致，15个亚基对细胞的存活是必需的，14个亚基可以纯合敲除不影响细胞存活（non-essential），4个亚基在不同类型的细胞中功能不同，如MED12对B、T的存活是必须的，对ESC则没有影响。其中mMED中对细胞存活是非必需的，又不属于尾部模块的亚基，敲除后仅干扰小部分的基因表达。诱导性敲除骨架亚基MED14导致整个Mediator的失活，细胞周期停止，细胞变小，RNAseq显示转录组整体性下调，下调～7倍。mMED14的敲除导致Pol II和Pol II-S5信号显著降低，与Mediator能够招募并磷酸化Pol II的功能相一致。Mediator复合物对哺乳动物细胞的总体Pol II招募和转录组扩增都是必需的。敲除non-essential的尾部模块的亚基，发现随着亚基敲除数量的增加，被影响表达的基因数量增加。尾部的缺失导致转录组有中等程度的下调（～1.3倍）。被调控基因的启动子平均与10个H3K27Ac⁺H3K4me1⁺增强子相关，没有被调控的基因只有6个，说明mMED尾部在转录因子（TFs）和Pol II间形成了一个功能性的桥梁。同时，mMED尾部模块的缺陷导致mMED-Pol II或者mMED-CKM相互作用的增加。这或许能够解释Mediator如何促进TF激活Pol II，TF和尾部亚基相互作用，影响尾部的结构及尾部与Mediator核心的相互作用，进而调控Pol II的活化。

最后，进一步研究Mediator在启动子-增强子（P-E）相互作用过程中的功能。Mediator或Pol II（敲除其最大亚基RBP1）敲除显著降低Mediator、Pol II在受调控DNA的分布，但原位Hi-C实验表明敲除Mediator或者对P-E、P-P相互作用几乎没有影响。相反地，敲除cohensin蛋白RAD21不影响Pol II、MED26的招募，但显著降低P-E、P-P相互作用。研究进一步证明Mediator通过间接方式调控染色体的拓扑结构，即Mediator影响DNA甲基化和其他表观遗传修饰，调控染色体可接近性（accessibility），进而调控architectural protein的招募，染色体的拓扑结构。

总的来说，此项工作研究并解析了哺乳细胞Mediator的结构和功能，并提出了Mediator发挥功能的新机制，Mediator并不是充当一个拓扑结构上的主要桥梁，而是通过招募其它蛋白间接调控P-E相互作用。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.07.011