研究背景 ：膀胱癌，尤其是肌肉浸润性膀胱尿路上皮癌的治疗至今仍是一个难题。包括PD1/PD-L1在内的抗免疫检查点疗法仅使近30%的晚期疾病患者受益。新的靶点或联合治疗策略的研究有重要的临床治疗指导意义。作者通过对8个膀胱癌肿瘤样本和3个癌旁样本的单细胞RNA测序，并结合公共数据库中的3000多个膀胱癌样本的数据集，揭示膀胱癌肿瘤微环境的高度异质性，并且证实了炎性癌症相关成纤维细胞(iCAF)在肿瘤进展中的作用。 此外，作者通过构建iCAF的调控网络，进而阐明iCAFs的促肿瘤机制。

 

 

 

1. 单细胞测序数据鉴定细胞类型

通过tSNE降维聚类和已知的细胞类型marker，对质控后获得的52,721个单细胞进行细胞类型鉴定，共鉴定出8个细胞类群，分别是上皮细胞；内皮细胞；两种类型的成纤维细胞iCAFs、mCAFs；B细胞；髓系细胞；T细胞；以及肥大细胞。

 

接下来作者对上皮细胞(EpCAM+)进一步聚类分型，发现由于拷贝数变异(CNV)，肿瘤患者的上皮细胞表现出特异的表达模式。基于CNV分析，作者将上皮细胞分为4组：正常对照组、低CNV组、高CNV组、和未检测到CNV组。

 

表达差异分析发现一系列基因在对照组和未检测到CNV组中特别表达，但在肿瘤细胞（高CNV组）几乎不表达。GO富集分析表明，这些基因在免疫相关途径中富集（特别是B细胞相关途径。免疫荧光实验发现，与正常上皮细胞相比，癌细胞几乎丧失了产生免疫球蛋白的能力，并且它们表达的MHC-II分子水平较低。这些结果说明膀胱癌细胞可能为逃避免疫检测而下调免疫原性。用基因集变异分析(GSVA)发现，CNV高值组E2F靶、MYC靶和G2M检查点通路丰富，而炎症和其他免疫相关通路下调。这些结果进一步证实了膀胱癌晚期的癌细胞免疫原性降低，并表现出较高的增殖能力。

 

 

2. 髓系细胞再聚类分型

髓系细胞再聚集鉴定出7种细胞亚型：肿瘤相关巨噬细胞(TAMS)；单核细胞；增殖的髓样细胞；滤泡B细胞；CD1C+树突状细胞；交叉呈递树突状细胞；LAMP3+树突状细胞。

 

单核细胞大多来自正常粘膜组织，而肿瘤相关巨噬细胞则富集在癌组织中。而且，这两种细胞类型的转录本显示出持续的变化，表明招募到肿瘤区域的单核细胞被重新编程为肿瘤相关巨噬细胞。之后，作者利用轨迹分析和RNA速度分析进一步证实了这一现象。该结果为抑制或逆转免疫抑制微环境的形成提供了潜在的靶点。

 

在3个DC亚群中，LAMP3+ DCs主要富集在肿瘤样本中，而且LAMP3+DC高表达各种编码细胞因子的基因（CCL17、CCL19和CCL22）。已有研究表明CCL17和CCL22通过与Tregs膜上的CCR4，对Tregs有很强的趋化作用。因此作者推断LAMP3+DC亚群可直接或通过将Tregs募集到肿瘤区域来抑制CD8+T细胞。

 

3. 成纤维细胞亚型鉴定

成纤维细胞被分为两类：炎性癌症相关成纤维细胞（iCAF）和肌癌相关成纤维细胞（mCAF）。为了研究各亚群的功能，作者对iCAFs和mCAFs表达差异基因进行了GO富集分析。结果显示iCAFs与细胞外基质组织、细胞迁移调节和血管生成有关，而肌肉系统过程、局部粘连和细胞外基质相关通路在mCAF中显著富集。GSEA同样显示iCAF与细胞外基质的降解有关，表明iCAF在肿瘤转移中有潜在作用。此外，细胞因子-细胞因子受体相互作用途径也在iCAFs中富集，因此，作者研究了细胞因子在膀胱癌肿瘤组织中的表达水平。结果发现ICAF是CXCL12的主要来源，在TCGA BLCA数据生存分析发现，高表达的CXCL12与患者预后不良显著相关。

 

作者又通过SCENIC分析，进一步研究两种CAF亚群的功能。结果发现MEF2D和MEF2C是mCAF特异的基序，在肌肉线条的转录调控中具有深远的作用。而TCF21和TWIST2基序在iCAF中高度激活，TCF21与冠心病有关，能够增强平滑肌细胞的“纤维肌细胞”表型。

 

 

接下来，作者通过体外细胞实验、TCGA数据库数据挖掘、细胞-细胞相互作用网络构建的分析方法，深入探讨了肿瘤转移密切相关的iCAFs的在肿瘤发展过程中的作用机制。

 

（1）体外细胞实验验证iCAFs促进膀胱癌肿瘤细胞增殖

通过GO富集分析发现iCAFs具有生长因子活性，是各种生长因子的主要来源。IGF1是一种iCAF特有的生长因子，而IGF1与总体存活率较低有关。因此作者推断iCAF促进肿瘤细胞增殖。为验证这一结论，作者用流式细胞仪对iCAFs进行分选，并将其与膀胱尿路上皮癌细胞株进行体外共培养。结果表明共培养组显示出更高的增殖能力，这证实了iCAFs在膀胱癌中的促肿瘤作用。

 

 

（2）将scRNA-seq与公共数据集相关联

作者通过TCGA BLCA数据集研究了不同细胞类型的临床作用，发现只有iCAF和mCAF的积累与较差的总体存活率(OS)有关，表明CAF与膀胱癌的肿瘤进展密切相关。而且，进一步研究发现在来自TCGA的数据中，iCAF特异性标记物PDGFRA与膀胱癌患者不良的OS显著相关，而mCAF标记物RGS5则不相关，这表明iCAF可能比mCAF有更重要的促肿瘤作用。

 

 

（3）构建基于iCAF调控的细胞-细胞互作网络

作者利用CellphoneDB2分析工具，鉴定了不同细胞类型之间的细胞-细胞相互作用网络。结果发现，iCAF与其他细胞类型的相互作用最多，而且它们与内皮细胞的相互作用特别强。iCAFs分泌的CCL2和CXCL1能与内皮细胞表面高表达的ACKR1相互作用。iCAF产生VEGF，它们与内皮细胞上的VEGF受体结合，促进血管生成。此外，FGFR1在iCAFs和内皮细胞上表达，而FGFR3在肿瘤细胞上表达。这些受体可与成纤维细胞生长因子结合，具有促增殖作用。值得注意的是，高级别肿瘤细胞高表达IGF2，与iCAF上的IGF2R相互作用，促进肿瘤进展。总之，iCAFs可以促进肿瘤细胞和基质细胞的增殖，而且由于CAF是已证实的促肿瘤生长因子的来源，靶向CAF可能是膀胱癌治疗的最佳选择。