代谢功能障碍相关性脂肪性肝病（MASLD）逐渐成为全球肝病的主要病因，20%-30% 的 MASLD 患者会发展为代谢功能障碍相关性脂肪性肝炎（MASH），具体表现为肝损伤、炎症和纤维化。肝游离胆固醇是加速 MASH 进展的一个重要因素，肝细胞中胆固醇的蓄积可阻止 Hippo 效应子 TAZ 蛋白质体降解，而 TAZ 是 MASH 中纤维化的关键驱动因子。胆固醇积累过多会导致代谢功能障碍相关性脂肪性肝炎（MASH）中的纤维化，但人们对 MASH 中肝脏胆固醇代谢如何失调还不完全清楚。

编码 EH 域结合蛋白 1（EHBP1）的几个单核苷酸多态性（SNPs）在调节胆固醇水平方面具有潜在作用。EHBP1最初被鉴定为EHD家族蛋白的相互作用伙伴，该家族包含四个成员（EHD1-4），这些蛋白共同参与了细胞内部物质运输的重要环节。

美国西奈山伊坎医学院研究团队为了研究 EHBP1 在胆固醇代谢和 MASH 纤维化中的作用，以及炎症与 EHBP1 介导的胆固醇代谢之间的相互作用，在《Cell Metabolism》上发表《EHBP1 suppresses liver fibrosis in metabolic dysfunction-associated steatohepatitis》一文，证明 EHBP1 可抑制肝细胞中的低密度脂蛋白受体（LDLR）和低密度脂蛋白摄取，导致 TAZ 减少，进而抑制 MASH 纤维化。

研究结果

一、人和小鼠纤维化的 MASH 肝脏中 EHBP1 表达减少

图1  人和小鼠纤维化的 MASH 肝脏中 EHBP1 表达减少

 

• 通过共染 EHBP1 和肝细胞标记物肝细胞特异性抗原（HSA）来分析肝细胞 EHBP1 在人纤维化 MASH 肝脏中的表达，结果发现，与对照组相比，EHBP1 在 MASH 肝脏中明显减少。在人类和非人灵长类纤维化的 MASH 肝脏中，EHBP1 的表达也减少。

• 在几种伴有纤维化的 MASH 小鼠模型的肝脏 EHBP1 水平，包括纤维化和肿瘤 (FAT)-MASH 模型、果糖、棕榈酸酯、胆固醇和反式脂肪饮食 (FPC)、高脂肪、胆碱缺乏、L-氨基酸定义饮食 (CDAHFD) 以及高脂肪、高果糖和高胆固醇饮食 (FFC) MASH 模型中，肝脏 EHBP1 的 mRNA 和蛋白水平均显著下降。

• 利用 FAT-MASH模型来研究 EHBP1 在 MASH 肝纤维化中的作用，证实 Ehbp1 在 MASH 肝脏中的表达量减少。在小鼠纤维化的MASH肝脏中，涉及脂质、类固醇和胆固醇代谢的过程被显著下调，而涉及免疫反应、细胞外基质组织和细胞凋亡的过程被上调。

• 这些研究一致表明，EHBP1 和胆固醇代谢在纤维化的 MASH 肝脏中受到明显抑制。

• 为了确定胆固醇相关 EHBP1 SNP rs10496099 T>C26 是否与 MASH 进展相关，评估了1367 名组织学特征 MASLD 患者的 EHBP1 rs10496099 基因型，发现rs10496099 C 等位基因与较高的脂肪变性、坏死炎症和纤维化患病率相关。

• 评估了可获得 RNA-seq 数据的人体肝活检组织中 EHBP1 的表达情况，观察到携带 C 等位基因的患者 mRNA 水平降低，这表明 EHBP1 rs10496099 T>C 变异是功能缺失的。

二、肝细胞中的 EHBP1缺失会促进 MASH 的肝纤维化

图2  肝细胞中的 EHBP1缺失会促进 MASH 的肝纤维化

 

• 使用由 H1 启动子驱动的带有 Ehbp1 靶向短发夹-RNA（shEhbp1）的 8 型腺相关病毒（AAV8）载体（AAV8-H1-shEhbp1）来敲除肝细胞中的 Ehbp1，通过向 C57BL/6J 野生型（WT）小鼠静脉注射（IV）AAV8-H1-shEhbp1，并在喂食脂肪-MASH 食物 10 周后检查肝脏组织学，包括脂肪变性、炎症和纤维化。发现AAV8-H1-shEhbp1 处理特异性减少了肝脏EHBP1，但没有减少肺、脾、肾和肌肉的 EHBP1。

• 与对照组（AAV8-H1-shCon）相比，EHBP1 沉默增加了肝脏脂肪变性和炎症，表现为脂滴面积增加、炎症细胞和炎症基因-Adgre1、Tnfa 和 Ccl2 以及 %F4/80+ 面积增加。还发现沉默 EHBP1 会诱导肝纤维化，与对照组相比，天狼星红染色、纤维化基因表达和 αSMA+ 面积都有所增加。与肝脏组织学结果一致，shEhbp1 处理的 MASH 小鼠血浆 ALT 和 AST 水平升高，表明肝细胞 EHBP1 沉默的 MASH 小鼠肝损伤程度升高。

• EHBP1沉默的MASH小鼠中上调的基因富集于涉及胶原纤维组织、细胞外基质组织和免疫系统过程的通路，而下调的基因富集于环氧酶P450通路、异种生物代谢过程和脂质代谢过程。使用 Gubra Amylin (GAN) MASH 饮食喂养 shCon- 和 shEhbp1 处理的小鼠 26 周，与 FAT-MASH 模型一致，在 GAN 饲喂的 MASH 小鼠中，沉默 EHBP1 也会促进肝脏脂肪变性、炎症和纤维化以及血浆谷丙转氨酶和谷草转氨酶的升高，而且即使 26 周后 GAN 饮食也会导致轻度纤维化。

• 这些研究发现，肝细胞 EHBP1缺失会加速肝脏脂肪变性、炎症和纤维化，从而促进 MASH。

三、肝细胞中 EHBP1 的过表达可消除 MASH 的肝纤维化

图3  肝细胞中 EHBP1 的过表达可消除 MASH 的肝纤维化

 

• 使用肝脏特异性甲状腺素结合球蛋白 (TBG) 启动子 (TBGS1) 的缩短版，在肝细胞中特异性过表达 EHBP137，与 EHBP1 沉默不同的是，EHBP1 在肝细胞中的过表达减轻了肝脏脂肪变性和炎症，表现为脂滴面积减少、炎症细胞和炎症基因减少。

• EHBP1 的过表达也减轻了肝纤维化，AAV8-TBGS1-Ehbp1 处理的 MASH 小鼠的天狼星红染色、纤维化基因表达、αSMA+ 面积以及血浆谷丙转氨酶和谷草转氨酶均有所下降。

• 体内 EHBP1 功能缺失和功能增强的研究证明，肝细胞 EHBP1 对 MASH 起着保护作用。

四、EHBP1 可抑制 MASH 中的肝脏低密度脂蛋白胆固醇还原酶、游离胆固醇和 TAZ

图4  EHBP1 可抑制 MASH 中的

肝脏低密度脂蛋白胆固醇还原酶、游离胆固醇和 TAZ

 

• 因为EHBP1 SNPs 与低密度脂蛋白胆固醇有关，所以确定 EHBP1 是否调控 LDLR（一种介导低密度脂蛋白胆固醇摄入肝细胞的受体），发现虽然在 shEhbp1 处理的 FAT-MASH 小鼠肝脏中 Ldlr mRNA 没有改变，但 LDLR 蛋白水平却显著增加。

• 测量从 shCon- 和 shEhbp1 处理的小鼠分离的原代肝细胞中细胞表面的 LDLR，发现沉默 EHBP1 增加了肝细胞中细胞表面的 LDLR。细胞表面 LDLR 的增加与 EHBP1 沉默的 MASH 小鼠肝脏总胆固醇的升高有关。进一步测量游离胆固醇，发现EHBP1沉默的MASH小鼠肝脏中游离胆固醇增加，游离胆固醇探针Filipin染色增强。

• 与肝细胞 EHBP1 沉默的结果相反，EHBP1 过表达会导致肝脏总 LDLR 蛋白水平和肝细胞表面 LDLR 水平显著降低，而不会改变肝脏 Ldlr mRNA。EHBP1 暴露的 MASH 小鼠肝脏总胆固醇、游离胆固醇和 TG 水平也降低。

• 在原代肝细胞中沉默 EHBP1 会诱导 LDLR 蛋白水平，但不会诱导其 mRNA 水平，EHBP1 沉默的肝细胞对 LDL 的摄取也增加。

• 接下来确定 EHBP1 是否调节 MASH 肝脏中 TAZ 的稳定性，发现肝细胞 EHBP1 沉默的 MASH 肝脏在蛋白水平上增加了 TAZ，并增加了 Ihh mRNA。与 EHBP1 沉默相反，EHBP1 过表达降低了 TAZ 蛋白水平，并抑制了 FAT-MASH 小鼠的 Ihh mRNA，沉默 EHBP1 提高了原代肝细胞中 TAZ 蛋白水平。

• 这些数据表明，EHBP1 可通过降低 LDLR、肝脏胆固醇和 TAZ 来防止 MASH 纤维化。

五、EHBP1 可促进 sortilin 介导的 PCSK9 分泌

图5  EHBP1 可促进 sortilin 介导的 PCSK9 分泌

 

•  PCSK9 是通过将细胞表面 LDLR 靶向溶酶体降解来调节 LDLR 的重要机制，因此研究 EHBP1 是否在 PCSK9 介导的 LDLR 降解中发挥作用，发现 EHBP1 沉默的 MASH 小鼠血浆 PCSK9 水平降低，而 EHBP1 表达的 MASH 小鼠血浆 PCSK9 水平升高。

• 检测 EHBP1 是否调控原代肝细胞中 PCSK9 的分泌，结果发现沉默 EHBP1 会减少小鼠和人类原代肝细胞培养基中分泌的 PCSK9，而不会改变肝细胞中的 Pcsk9 mRNA，这表明 EHBP1 促进了 PCSK9 的分泌。

• 推测 EHBP1 通过调节 sortilin 来促进 PCSK9 的分泌，结果发现在 EHBP1 缺失的小鼠和人类原代肝细胞中，sortilin 减少。与 EHBP1 的减少类似，肝脏 sortilin 在 MASH 进展过程中也减少了，而且小鼠和人类 MASH 肝脏中的肝细胞 sortilin 都减少。

• 这些结果表明，EHBP1 通过增强 sortilin 来促进 PCSK9 的分泌。

• 环己亚胺（CHX）追逐试验表明，EHBP1沉默会加速sortilin的降解，这表明EHBP1促进了sortilin的稳定性。 EHBP1 在离体的小鼠原代肝细胞和 AML12 细胞中与 sortilin 和 retromer 单元-Vps35 和 Vps26a 相互作用，共聚焦显微镜证实 EHBP1 与肝细胞中的 sortilin 和 Vps35 retromer 部分共定位。

• 为了进一步确定肝细胞中sortilin和retromer功能之间的联系，敲除retromer单元，包括Vps26a、Vps35和SNX1，并测定了retromer对sortilin的影响。发现缺乏 retromer 复合物会显著降低原代肝细胞和 AML12 细胞中的 sortilin。与 retromer 缺失的肝细胞中 sortilin 减少一致，发现 retromer 复合物的缺乏会减少原代肝细胞的 PCSK9 分泌，而这与 LDLR 和 TAZ 的增加有关。LDLR 的增加与 LDL 吸收的增加有关，这表明 retromer 的缺乏可能会通过增加 LDL 胆固醇的吸收来增强 TAZ。

• 这些数据表明，EHBP1 可通过调节 retromer 促进 sortilin 介导的 PCSK9 分泌。

六、稳定 retromer 复合物可预防 MASH

图6  稳定 retromer 复合物可预防 MASH

 

• 用稳定Vps35、Vps29和Vps26的三聚体核心复合物的药理学伴侣TPT-260治疗MASH小鼠，TPT-260没有增加EHBP1，TPT-260处理显著降低了血浆ALT和AST，表明逆转录复合物在MASH中的保护作用。

• 肝组织学分析显示，TPT-260改善了肝脂肪变性、炎症和纤维化，在TPT-260处理的MASH小鼠中，脂肪变性和炎症评分均较低。

• 测量TPT-260处理的MASH肝脏中的总胆固醇和游离胆固醇，发现TPT-26显著降低了肝脏总胆固醇和游离胆固醇水平，并且发现在TPT-260处理的MASH肝脏中TAZ也降低。

• 这些数据表明，稳定逆转录体复合物可能是治疗MASH的新治疗方法。

七、TNF-α 可抑制肝细胞中 EHBP1 的表达

图7  TNF-α 可抑制肝细胞中 EHBP1 的表达

 

• 炎症加剧是 MASH 的特征之一，它通过上调与肝脏脂质代谢和纤维化相关的关键分子，在 MASH 进展过程中发挥着关键作用。接下来研究了 TNF-α 的增加在 MASH 中作为 EHBP1 抑制因子的潜在作用，用重组 TNF-α 处理原代小鼠肝细胞，发现 TNF-α 处理会减少 EHBP1 并增加 TAZ。由于 TNF-α 在人和小鼠 MASH 肝脏（包括 FAT-MASH、FPC 和 CDAHFD 肝脏）中均有表达，说明MASH 期间 EHBP1 受抑制可能是 TNF-α 增加的结果。

• TNF-α处理抑制了Ppara和Ehbp1的表达，在 WT 肝脏中，PPARα 与 Ehbp1 启动子区域的结合增强，而在 Ppara-/- 肝脏中则消失，这表明 PPARα 可能是 EHBP1 的转录因子。当使用 siRNA 沉默 Ppara 时，PPARα 的缺乏会降低 EHBP1 在原代肝细胞中的表达。与 EHBP1 的减少结果一致，原代小鼠肝细胞中 PPARα 的沉默也导致 sortilin 的减少以及 LDLR 和 TAZ 的增加。

• 这些数据共同表明，在 MASH 进展过程中，TNF-α 通过抑制肝细胞中的 PPARα 来抑制 EHBP1 的表达。

结论

研究表明，人类纤维化的 MASH 肝脏中与低密度脂蛋白胆固醇相关的全基因组关联研究（GWAS）位点 EH-domain-结合蛋白 1（EHBP1）减少以及EHBP1 的功能缺失能够促进 MASH 纤维化水平。具体而言，EHBP1基因的rs10496099位点上，T碱基突变为C碱基与肝脏中EHBP1蛋白表达降低和MASH症状加重有关。EHBP1蛋白能够减少LDLR（低密度脂蛋白受体）的表达，降低胆固醇的摄取，以及抑制TAZ（转录共激活因子）的活性。此外，EHBP1还促进了sortilin介导的调节胆固醇代谢的蛋白PCSK9（前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型）的分泌。针对EHBP1的这一功能，通过稳定retromer（一种细胞内运输复合体）的治疗策略可以有效改善MASH症状。这些发现为治疗相关疾病提供了新的分子靶点和治疗思路。